Basisprotocol voor Laboratorium Diagnostiek van Hemoglobinopathie Dragerschap ten Behoeve van Preventie

Giordano P.C.
Hemoglobinopathieën Laboratorium,
Humane en Klinische Genetica,
Leids Universitair Medisch Centrum
Introductie

Dragerschap voor de meest voorkomende en tevens pathologisch meest relevante HbP vormen (HbS, HbE, HbC, HbD, b- en a-thalassemie) wordt met hoge frequenties geconstateerd in Mediterrane, Afrikaanse en Aziatische populaties.


Preventie protocol

Preventiestrategieën zijn in diverse landen toegepast. De meest succesvolle zijn gebaseerd op informatie aan jonge aanstaande ouders en op het aanbieden van dragerschaps-diagnostiek op individuele basis. Dit preventieprotocol begint meestal in de HA- of specialistenpraktijk en wordt gefaseerd aangeboden. Na informatie verstrekking wordt in eerste instantie één van de twee partners onderzocht, bij voorkeur de vrouw. Bij een negatieve uitslag is het paar niet "at risk" en hoeft de partner niet te worden onderzocht. Bij een positieve uitslag dient de partner te worden onderzocht.
Bij een negatieve uitslag van de partner is het paar nog steeds niet "at risk".
Bij positieve uitslag van de partner is het paar wel "at risk" en dient voor nadere genetische informatie en advies naar één van de Klinische Genetische Centra te worden verwezen (zie strategie schema).

Strategie voor HbP preventie in Nederland


Dragerschapsanalyse

Hoe worden potentiële dragers door de arts of klinisch chemicus herkend?
Dragers van a- of b-thalassemie en van HbE kunt u herkennen aan hun microcytair bloedbeeld (FlowChart 1). Dragers van HbS, C en D vertonen doorgaans licht afwijkende of normale bloed parameters, meestal zonder anemie, waardoor slechts de etnische afkomst of de familie geschiedenis als indicatie kan dienen.

  • Eerste stap: Indicatie op grond van persisterende anemie, afwijkende bloed parameters of verdenking wegens anamnese of etnische achtergrond.
    Er wordt op een microcytair hypochroom bloedbeeld gelet, met of zonder anemie, bij normale ferritine waarde, of persisterend na ijzer suppletie, vooral bij allochtone maar ook bij autochtone patiënten. Er wordt tevens aandacht besteed aan patiënten zonder duidelijk afwijkende bloed parameters die een familie geschiedenis met HbP hebben of/en vanwege hun etnische achtergrond een verhoogde dragerschapskans zouden kunnen hebben voor de mutanten HbS, C of D (Negroide, Mediterrane of Aziatische afkomst). Zie FlowChart 1:

    FlowChart1

  • Tweede stap: De Hb-pathie routine analyse.
    Bij een persisterend microcytair bloedbeeld, zonder ijzer gebrek, of bij één van de andere indicaties, wordt het laboratorium geraadpleegd voor een Hb-elektroforese of Hb-chromatografie (HPLC) met een quantitatieve bepaling van de HbA2 en HbF fracties. Hiermee worden de normale (HbA, HbA2 en HbF) en meest voorkomende abnormale Hb fracties (HbS, C, E, D, e.a.) geanalyseerd. Zie flowchart 2:

    FlowChart2

Hb ketensynthese kunt u telefonisch afspreken op het Hemoglobinopathieën Laboratorium te Leiden.
DNA analyse kunt u direct aanvragen door één buisje EDTA bloed met het ingevulde aanvraagformulier per snelpost te versturen.

Aantonen van HbS door middel van Sikkelceltest

Hemoglobine S (HbS) is een veelvoorkomend abnormaal hemoglobine en is met een eenvoudige test aan te tonen. HbS vormt lange polymeren in een zuurstofarme omgeving. Dit fenomeen veroorzaakt vervorming van de erythrocyten tot sikkelachtige abnormale cellen. Het is mogelijk dit fenomeen in vitro te reproduceren d.m.v. de sikkeltest:

Benodigdheden:
  1. bloedmonster (volbloed)
  2. Na-metabisulfiet, 1% oplossing in PBS(vers). Bij lage HbS percentages en/of HbF gebruik 2% oplossing. Los het zout op niet op een vortex maar door rustig te mengen.
  3. microscoopglaasjes, dekglaasjes
  4. solutie-lijm
  5. reageerbuis
Handelingen:
  • Meng in de reageerbuis 5 druppels Na-Metabisulfiet-oplossing met 1 druppel bloed.

    • Sikkelcel test
  • Deponeer één druppel van het mengsel op het microscoopglaasje.
  • Dek de druppel met een dekglaasje af (zonder er luchtbellen onder te laten).
  • Veeg het overtollige vocht om het dekglaasje voorzichtig af.
  • Plak de rand van het dekglaasje af met solutie. Moet wel goed lucht dicht zijn.

    • Sikkelcel test
  • Bekijk na 30 minuten onder de microscoop (100 maal vergroting met immersie-olie).
Klik hier voor een plaatje van sikkelcellen.

Aantonen van a° thalassemie door middel van inclusionbodies test

Bij alfa° thalassemie allelen (--/aa) kunnen door zeldzame somatische (-a/) mutaties, sporadische erythrocyten ontstaan met hetzelfde overschot aan b globine als bij HbH ziekte (--/-a) het geval is.
Deze rode cellen (b4 inclusion bodies) zijn aantoonbaar op een uitstrijkje van EDTA bloed, na 30 minuten incubatie 1:1 met gefilterd 1% brilliant cresyl blue oplossing in PBS op 37° C. Twee uur incubatie op kamer temperatuur met dezelfde oplossing is ook mogelijk.

Klik hier voor een plaatje van inclusionbodies.

Hoe worden de uitslagen geïnterpreteerd?
  • Bij een abnormale Hb fractie op electroforese of HPLC op positie S is een bevestiging via sikkelceltest nodig. Bij een positieve sikkeltest (zie figuur sikkeltest) in aanwezigheid van circa 60% HbA is (in een niet getransfundeerde patiënt!) sprake van een HbS drager (heterozygoot HbA/S) (zie electroforese en HPLC illustratie).
  • Bij een abnormale Hb fractie op electroforese of HPLC op positie S en een positieve sikkeltest zonder HbA is er sprake van een patiënt met sikkelcelziekte (homozygoot HbS/S, of HbS/b-thalassemie) (zie electroforese en HPLC illustratie).

Andere mutanten

  • Abnormale banden op positie C, D, E of op andere posities, wel of niet in combinatie met HbS of HbA dienen in een gespecialiseerd laboratorium nader te worden gekarakteriseerd.
  • Bij HbA2 percentages tussen 3.5 en 8% zal doorgaans sprake zijn van een heterozygoot b-thalassemie (de HbA2 waarde is niet van diagnostische betekenis bij babies en er zijn echter zeldzame b-thalassemie vormen die gepaard gaan met een normale HbA2 waarde van 2,5-3.5%).
  • Bij een HbA2 percentage £ 2.5% zonder ijzer depletie, zou er sprake kunnen zijn van een a-thalassemie (bevestiging dient in een gespecialiseerd laboratorium te worden gedaan).
  • HbF percentages boven de 1% zijn vanaf het 2de levensjaar abnormaal. Bij b-thalassemie heterozygoten is de HbF soms licht tot sterk verhoogd.

Starch gel

De technische aanpak en materiaal keuze

Verschillende methodieken zijn beschikbaar voor dragerschapsdiagnostiek van HbS, C, E, D, β- en α-thalassemie. Naast de manuele methodieken zoals Hb-electroforese en bepaling van het HbA2 percentage, bestaan tegenwoordig geautomatiseerde HPLC methoden.
Uitgebreide evaluaties van de 'Variant I' HPLC (Bio-Rad) heeft in het Hemoglobinopathieën Laboratorium te Leiden en in andere specialistische centra (Waters et al. 1998) tot een positieve beoordeling van dit apparaat geleid, dat speciaal voor HbP diagnostiek is ontworpen en dat in staat is zowel de kwalitatieve als de kwantitatieve parameters te produceren die noodzakelijk zijn voor basis HbP diagnostiek. De Menarini HA 8160 is een ander HPLC apparaat ontwikkeld voor HbA1c bepaling die ook Hb-pathie diagnostiek kan doen. De 'Variant II', de opvolger van de 'Variant I', kan ook de beide analyses verrichten.
Hier volgen voorbeelden van dragerschapsdiagnostiek voor vaak voorkomende Hb-pathieën verricht met de HPLC 'Variant I' (Bio-Rad) met gebruik van de β-thalassemia short program kit, en op de Menarini HA 8160 opgesteld in HbA2 mode.

















Conclusie

  • Informatie en dragerschapsdiagnostiek kunnen op eenvoudige wijze in Nederland worden aangeboden, zonder stigmatiserende screeningsmethoden, in de privacy van de huisarts en specialisten praktijk (Giordano & Harteveld 1998).
  • Dragerschapsdiagnostiek kan in de meeste centrale laboratoria met de geautomatiseerde HPLC VARIANT of met andere automatische of manuele methoden worden verricht.
  • Bij onvoldoende ervaring kan worden verwezen naar andere geroutineerde laboratoria. Bij complexe casi, verdenking van risicoparen, en risicovaststelling, kan (kosteloos) naar het referentie lab (Het Hemoglobinopathieën Laboratorium te Leiden) worden verwezen.
  • De onderzoeksaanvrager dient over het belang van vervolg onderzoek t.b.v. preventie te worden gewezen als het laboratorium een positieve dragerschapsdiagnose heeft vastgesteld. Hiervoor volgen korte informatieteksten ten behoeve van de onderzoeksaanvragende arts, die de aandacht op het belang van vervolgonderzoek moeten richten.
Korte teksten ter informatie van de onderzoekaanvrager ter begeleiding van een positieve HbP dragerschapsuitslag voor de HbS, C, E, D, a- en b-thalassemie defecten

Bij Kind: Patiënt is drager bevonden van ..... . I.v.m. het mogelijk aanwezig genetische risico voor ernstige vormen van HbP is het geïndiceerd de beide ouders (en familie) te informeren en op HbP dragerschap te laten controleren.

Bij Jong-volwassen: Patiënt is drager bevonden van ..... . I.v.m. het mogelijk aanwezig genetische risico voor ernstige vormen van HbP in het nageslacht is het geïndiceerd de patiënt te informeren en de eventuele partner en familie op HbP dragerschap te laten controleren.

Bij ouderen: Patiënt is drager bevonden van ..... . I.v.m. het mogelijk aanwezig genetische risico voor ernstige vormen van HbP is het geïndiceerd patiënt en nageslacht van patiënt te informeren en op HbP dragerschap te laten controleren. Voor alle jonge HbP dragers is partneronderzoek geïndiceerd.
Folders en Informatie

Voor aanvullende informatie over laboratoriumdiagnostiek, preventie en voor informatiefolders t.b.v. uw patiënten in verschillende talen:
Hemoglobinopathieën Laboratorium       tel.: 071-5269800
Afd. Humane en Klinische Genetica (LUMC)
Einthovenweg 20
Postbus 9600, 2300 RC Leiden
Email: p.c.giordano@lumc.nl